Nanophotometer Anwendungsbeispiel – direkte Quantifizierung von Proteinen im Mikrovolumen

NP80 - Zum Vergrößern bitte Klicken!

 

Proteine sind in fast allen Stoffwechselvorgängen von Zellen beteiligt: Die Messung von Proteinkonzentrationen ist daher ein häufig verwendetes Verfahren im Laboralltag. Die Wahl der Methode basiert normalerweise auf Kriterien wie einfache Durchführung, Menge und Reinheit des verfügbaren Proteins. In diesem Anwendungsbeispiel beschreiben wir die Einsatzmöglichkeiten des NanoPhotometer® NP80 in Bezug auf Linearität und Genauigkeit bzw. die Möglichkeit einer direkten Quantifizierung bei 280 nm im Mikrovolumenbereich.

Quantifizierung bei 280 nm (Protein UV 280)

Proteinproben zeigen ein charakteristisches Absorptionsspektrum bei 280 nm (Noble, J. E. et al. 2009), das vor allem durch die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan hervorgerufen wird. Das Lambert Beer'sche Gesetz kann bei dieser photometrischen Bestimmungsmethode angewendet werden.

 


Technische Daten des NanoPhotometer® NP80

Das NanoPhotometer® NP80 ist ein Spektralphotometer (200-900 nm) mit der Möglichkeit sehr kleine Volumina zuverlässig zu messen (Riepl, et M. al. 2011). Ein kleiner Probentropfen (0,3 µL) wird mit Hilfe der patentierten Compression Technology™ auf zwei unterschiedliche Schichtdicken „gedrückt“. Probleme, die aufgrund der geringen Oberflächenspannung eines Lösungsmittels auftreten, sind nicht mehr vorhanden. Verdunstungseffekte werden durch die Abdeckung ebenfalls vermieden. Eine zuverlässige Quantifizierung von Proteinen, die sich in flüchtigen Lösungsmitteln, z.B. Toluol, befinden, ist mit dieser Technik daher möglich. Die True Path Technology™ nutzt über die Lebensdauer des Geräts hinweg für die Einhaltung der zwei unterschiedlichen Lichtweglängen zwei feste Ankerpunkte. Das NanoPhotometer® NP80 deckt einen Konzentrationsbereich von 0,03 bis 478 mg/ml BSA ab. Es sind keine Rekalibrierungen und Wartungen erforderlich.

 

Linearität und Präzision

Wie bei früheren NanoPhotometer® Modellen zuvor gezeigt (Riepl, M. et al., 2011), bietet auch das NanoPhotometer® NP80 äußerste Genauigkeit bei Proteinquantifizierung in sehr kleinen Volumina. Die Linearität und die Reproduzierbarkeit verschiedener Protein-Quantifizierungsverfahren wurden mit dem NanoPhotometer® NP80 verifiziert. Für diesen Zweck wurden unterschiedliche Konzentrationen von Rinderserumalbumin (BSA) in einer seriellen Verdünnung von 320 mg/ml bis 0,125 mg/ml hergestellt. Drei unabhängige Messungen sind für jede Verdünnungsstufe durchgeführt worden. Vor jeder Messung wurde die Probe gut durchmischt und jeweils 1,5 µl aufgetragen. Nach jeder Messung wurde die Messkammer (Fenster und Spiegel im Deckel) mit einem leicht angefeuchteten fusselfreien Tuch gereinigt und ein neues Aliquot der Probe auf das Messfenster pipettiert.

 


Ergebnisse

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Wir haben gezeigt, dass das NanoPhotometer® NP80 für die Quantifizierung von gereinigten Proteinen höchst zuverlässig einsetzbar ist. Die sich ergebende Linearitätskurve zeigt eine enge Korrelation zwischen den erwarteten und den gemessenen Konzentrationen mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von 0,9999. Die Standardabweichung für die wiederholten Messungen ist minimal, und unterstreicht damit die hohe Genauigkeit. Die Variationskoeffizienten (CV) waren ebenfalls sehr gering und lagen im Bereich zwischen 0,01% und 0,02%. Die Möglichkeit kleine Volumina zu messen ist daher für Labore geeignet, bei denen das Ausgangsmaterial nur begrenzt vorhanden ist und eine schnelle Antwort ohne Vorverdünnung erforderlich ist. Eine Rückgewinnung der Probe für nachfolgende Anwendungen ist nach der Messung möglich.



Nanophotometer Modelle

Die neuen NanoPhotometer® Geräte eröffnen neuartige Anwendungs- und Einsatzmöglichkeiten innerhalb und außerhalb der Laborräume. Die Steuerung der Geräte bietet ein Höchstmaß an Flexibilität. Es lassen sich sehr kleine Probenvolumina auch mit geringer Oberflächenspannung sicher messen. Die Geräte sind über die gesamte Lebensdauer wartungs- und rekalibrationsfrei.


Modelle:


  • NP80: für Nanovolumen und Küvetten, inkl. Vortex
  • NP60: für Nanovolumen, inkl. Vortex
  • NP50: für Nanovolumen
  • C40: für Küvetten
NP80, NP60 & C40

Produktvideo

 

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