Automatisiertes Imaging und Analyse eines Comet-Assays im Hochdurchsatzformat zur Bestimmung der Genotoxizität von Substanzen

 

 

 

Genotoxine, die einerseits natürlich in unserer Umwelt vorkommen und andererseits als Stoffwechselendprodukte auftreten, können bei Kontakt Zelltod, Genmutationen und Krebserkrankungen hervorrufen. Sehr viele therapeutische Ansätze, z.B. Chemo- und Strahlentherapien, weisen ebenfalls eine Genotoxizität auf, die für die Behandlung von Tumorzellen wiederum gewünscht und erforderlich ist. Die Fähigkeit, beschädigte DNA effizient und präzise wiederherzustellen, hängt dabei von der zellulären DNA-Reparaturfähigkeit des Organismus ab. Das Ausmaß bzw. die Quantifizierung von DNA-Schäden und die genaue Messung der Geschwindigkeit, inwieweit Schäden wieder rückgängig gemacht werden, spielt in der Arzneimittelentwicklung daher eine wichtige Rolle.

 

Abb.: 3-well CometSlides: Aufnahmen mit einem 2,5x Objektiv. Kontrollzellpopulationen mit hohen (CC3), mittleren (CC2) und niedrigen bzw. keinen nennenswerten DNA-Schäden (CC1) im Vergleich zum normalen Niveau (CC0).

Der Comet-Assay ist mittlerweile ein etablierter Test für die Quantifizierung von DNA-Schäden in Säugetierzellen und kann eine Vielzahl von DNA-schädigenden Substanzen detektieren. Überdies kann dieser Assay auch verwendet werden, um die Wiederherstellung zellulärer DNA in unterschiedlichen Reparaturwegen zu messen.

Das Prinzip des Assays ist die Migration einer fragmentierten DNA in einem elektrischen Feld (Elektrophorese-Gel), in dem sich intakte DNA (Kometenkopf) mit einer geringeren Geschwindigkeit als fragmentierte DNA (Kometenschweif) bewegt. Die Auswertung der fluoreszenz-gefärbten Objekte erfolgt dabei mittels Mikroskopie. Der ermittelte Prozentsatz an fragmentierter DNA im Kometenschweif ist ein direktes Maß für die DNA-schädigende Wirkung einer Testsubstanz.

 

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Cytation5 Cell-Imaging Multi-Mode Reader von BioTek

In den meisten Fällen werden Comet-Assays manuell durchgeführt, wobei die Auswertung zwar eine hohe Sensitivität der mikroskopischen Aufnahmen ermöglicht, die Praxis jedoch mit einem sehr hohen Zeitaufwand verbunden ist.

 

Abb.: 1) Zellen werden in einer low melting Agarose gemischt, 2) Immobilisierung der Zellen auf einem Objektträger, 3) Lyse von Zellen, 4) alkalische Denaturierung von dsDNA und 5) Markierung der DNA mit interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen und Auftrennung in einem elektrischen Feld

Mit dem Cytation5 lassen sich dabei zwei Arbeitsschritte automatisieren:

 

  • Imaging
  • Auswertung

Cytation5 übernimmt die Funktionen des Mikroskopierens und der Datenauswertung. Der am häufigsten verwendete Comet-Assay-Wert ist der sog. percent DNA in tail. Dieser Wert berücksichtigt die Änderung eines kreisförmigen Kometen, wenn dessen DNA durch eine Substanz beschädigt worden ist. Wenn während der Elektrophorese nur wenig bis gar keine Migration stattfindet, erscheint der Komet folglich als grüner Punkt mit hoher Zirkularität. Beschädigte DNA würde aus vielen Fragmenten mit unterschiedlichen Längen bestehen. Wie bei einer herkömmlichen Elektrophorese bewegen sich im elektrischen Feld kurze Fragmente schneller als längere. Die Form des Kometen besteht nach DNA-schädigender Wirkung aus Kometenkopf (unbeschädigter DNA) und Kometenschweif (fragmentierter DNA).

 

Abb.: Kometenkopf und Kometenschweif in Abhängigkeit beschädigter DNA

Ready-to-Use-Slides von Trevigen



Der Comet-Assay kann mit dem Cytation5 sowohl auf einzelnen CometSlides als auch auf CometChips bei großen Probenzahlen in Hochdurchsatzformat durchgeführt werden. Cytation5 erfasst die gefärbten Fluoreszenzobjekte in Einzelaufnahmen oder Bildmontagen und übernimmt danach eine entsprechende Quantifizierung. Typische Werte, wie procent DNA in tail oder tail moment length, lassen sich durch die Datenauswertefunktion der Gen5-Software darstellen.

 

 

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 Die Produkte, die BioTek für diese Applikationsschrift verwendet hat, sind bei unserem Handelspartner Trevigen erhältlich.

  

Die vollständige BioTek-Applikationsschrift zu diesem Thema finden Sie unter diesem Link.

 

Mehr Informationen zu BioTeks Cytation5 finden Sie hier.

 

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