Wann haben Sie das letzte Mal getestet? Nicht sich selbst, sondern Ihre Zellkultur? Mykoplasmen-Kontaminationen sind bei Zellkulturen ein altbekanntes, aber immer noch gerne ignoriertes Problem. Derzeit testen nur ca. 30% der Zellkulturlabore auf Mykoplasmen. Lesen Sie welchen Schaden Mykoplasmen anrichten können und wie wir Sie mit den MycoAlertTM Produkten von Lonza dabei unterstützen.

Welche Auswirkungen kann eine Kontamination mit Mykoplasmen auf Zellen haben?

Die Auswirkungen auf eukaryotische Zellen können mannigfaltig sein. Hier ein paar Beispiele:

  • Inhibierung des Zellmetabolismus
  • Induktion von chromosomalen und mophologischen Änderungen
  • Änderungen in der DNA, RNA und Protein-Synthese
  • Erhöhte Sensitivität gegenüber Auslösern von Apoptose
  • Änderungen in der Membran-Antigenität
  • Änderungen in der Transfektions Effektivität
  • Einfluss auf Virenproduktion
  • Erhöhte Zelltod-Rate

Wie kann man eine Mykoplasmen-Kontamination entdecken?

Es gibt die unterschiedlichsten Möglichkeiten, die meisten davon sind PCR-basiert. Der MycoAlert von Lonza ist ein einfacher biochemischer Test, der 20 Minuten dauert und die Aktivität der mycoplasmischen Enzyme zum Nachweis benutzt. Die Präsenz dieser Enzyme erlaubt einen einfachen und sicheren Nachweis von Mykoplasmen in der zu untersuchenden Probe. Lebende Mykoplasmen werden lysiert und das Enzym reagiert mit dem MycoAlert Substrat, dadurch kommt es zu einer Umwandlung von ADP zu ATP. Der Gehalt von ATP in der Probe wird über eine Luciferase-Reaktion gemessen. Es gibt zwei Leseschritte, einen vor und einen nach Zugabe des MycoAlert Substrates. Aus diesen beiden Messungen kann ein Verhältnis errechnet werden, welches Aufschluss über die potentielle Gegenwart von Mykoplasmen gibt. Ist die Probe sauber, kommt es zu keiner Erhöhung des ATP-Levels. Sind Mykoplasmen in der Probe, kommt es zu einer eindeutigen Erhörung des ATP-Levels was zu einer verstärkten Lichtreaktion führt. Lonza bietet mit der Lucetta2 auch das passende Luminometer an.

Können Mykoplasmen auch in Abwesenheit von Zellen wachsen?

Darauf gibt es Hinweise, im Regelfall wachsen Mykoplasmen in der Anwesenheit von Zellen. Der MycoAlert PLUS Kit von Lonza kann auch Kontaminationen in zellfreien Medien, Seren und Zusätzen detektieren.

Kann MycoAlert das gesamte Spektrum von Mykoplasmen nachweisen?

Der Mykoplasmen-spezifische Metabolismus, der durch MycoAlert detektiert wird, ist in allen Spezies der Mollicutes (Mycoplasma, Acholeplasma, Entomoplasma und Spiroplasma) präsent, eine Ausnahme bildet Ureaplasma, welches aber im Regelfall keine Rolle in der Zellkultur spielt. Von allen Infektionen entstehen 95% durch M.orale, M.arginii, M.fermentans, M.salivarum, M.hyorhinis und A.laidlawii. MycoAlert kann alle diese Spezies nachweisen, darüber hinaus noch mindestens 44 weitere, auf die bisher getestet wurde.

Führen Bakterien zu einem falsch-positiven Resultat?

Nein. Das für die Lyse im Kit enthaltene Reagens ist nicht stark genug um Bakterien oder Hefen anzugreifen. Auch sind die verwendeten Enzyme normalerweise nicht in Bakterien oder Hefen präsent, sehr wohl aber in den Mollucuten. Eine Bakterien-Kontamination zeigt sich meist in einer raschen Zunahme der Trübung des Kulturmediums. Eine Mykoplasmen-Infektion führt nicht zu einer Trübung und deswegen ist die Notwendigkeit einer Testmethode wir MycoAlert gegeben.

Sind für MycoAlert Positiv-Kontrollen verfügbar?

Ja, ein Assay Control Set ist verfügbar. Dieses enthält eine lyophilisierte positive Kontrolle (1mL) sowie 2mL Assay Puffer zu rekonstituieren. Der Puffer dient auch als negative Kontrolle.  Die Kontrollen wurden speziell für den MycoAlert Kit entwickelt. Die Rezeptur der positiven Kontrolle ist geschützt, enthält aber keine Mykoplasmen. Die beiden Kontrollen werden wie eine Probe im Test behandelt, die positive Kontrolle ergibt bei den beiden Messungen ein Verhältnis von >1, die negative Kontrolle <1.

Welches Probenvolumen vom Kulturüberstand ist für akkurate Messergebnisse nötig?

Laut Standardprotokoll sollten 2mL Überstand genommen und abzentrifugiert werden. Dann sollten 100µL verwendet werden.

Welche Probe sollte verwendet werden? Kann sie gelagert werden?

Der MycoAlert Assay benötigt zellfreien Kulturüberstand. Der Überstand muss 5 Minuten bei 200 x g bzw. 1500 rpm zentrifugiert werden um alle Zellen zu entfernen. Zellen würden den Hintergrund erhöhen, die Sensitivität herabsetzen oder die Ergebnisse verfälschen. Optimalerweise wird der Überstand möglichst schnell verarbeitet. Sollte eine Lagerung nötig sein, muss diese bei 4°C erfolgen, wenn die Probe innerhalb eines Tages getestet wird. Ein bei -80°C gelagerter Überstand ist bis zu 6 Monaten verwendbar. In diesem Fall sollte der Überstand sofort nach dem Zentrifugieren eingefroren und bei Bedarf ohne zusätzlich Hitze wieder aufgetaut werden. Der Überstand sollte dann vor der Testung zumindest 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen bleiben.

Kann man im 96-well Format arbeiten?

Ja. Das Standard-Protokoll und das benötigte Volumen unterscheiden sich nicht von der Single-Tube Variante. Idealerweise verwendet man das Kit im 100-Tests-Format.

Welche Microtiter-Platten werden empfohlen?

Lonza empfiehlt zum Beispiel die Corning-Costar Platte mit der Artikelnummer 3912. Diese Platte garantiert sehr geringen Hintergrund und optimale Resultate in einem Platten-Luminometer.

Können mit dem MycoAlert die Ergebnisse auch quantifiziert werden?

Nein das ist nicht möglich. Der Assay ist für eine Ja/Nein Aussage konzipiert.

Wie ist der Assay validiert?

Der MycoAlert Assay ist für „Research Use Only“.

Was ist der Unterschied zwischen MycoAlert und MycoAlert PLUS?

Beide Assays basieren auf dem gleichen Prinzip. Der MycoAlert PLUS Kit generiert einen höheren Licht-Output und kann somit auf einer größeren Anzahl von Readern verwendet werden.

Was kann man bei einer Mykoplasmen-Kontamination mit den Zellkulturen machen?

Wenn eine Kontamination auftritt und die Probe absolut nicht verworfen werden kann, steht mit dem MycoZapTM Mycoplasma Elimination Reagent eine Möglichkeit zur Verfügung die Kontamination mit minimalem toxischem Effekt auf die Zellen zu beseitigen. MycoZap eliminiert Mykoplasmen durch eine Kombination von antibiotischen und antimetabolischen Agenzien. Diese Kombination wirkt in hohem Maße zuverlässig. MycoZap wirkt gegen Mollicutes sp. inklusive aller Spezies von Mycoplasma, Acholeplasma, Spiroplasma und Enteroplasma in Zellkulturen. Generell sollten Zellkulturen in regelmäßigen Intervallen von 4-6 Wochen nach einer Eliminierung mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit getestet werden.

Quelle: Lonza Resource Notes