Endotoxin

Endotoxin

Seit die pharmazeutische Industrie Injektionen jeglicher Art produziert sind Tests auf Pyrogene eine absolute Notwendigkeit. Pyrogene sind Substanzen, die Fieber, Schock und im Extremfall sogar den Tod eines Organismus verursachen können. Endotoxin ist ein Pyrogen von gramnegativen Bakterien. Es findet sich als natürlicher Bestandteil in deren äußerer Zellmembran. Freigesetzt wird es durch Zell-Lyse. Über 30 verschiedene biologische Aktivitäten von Endotoxin sind bekannt, dazu gehören Makrophagen-Aktivierung, mitogene Aktivität und Induzierung von Interferon und colony-stimulating factor.

Für lange Zeit war der „Rabbit Pyrogen Test“ das Mittel der Wahl. In den 1970er Jahren wurde dann der LAL-Test (Limulus Amebocyte Lysate) eingeführt. LAL kommt von den Blutzellen, den Amöbozyten, des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus. Frederick Bang und Jack Levin beobachteten, dass diese Amöbozyten in Gegenwart von gramnegativen Bakterien koagulierten. Daraus wurde die Technologie für den Endotoxin-Test abgeleitet.

Gel Clot LAL Assays

Der Pyrogent Gel Clot Assay ist ein qualitativer LAL Test für Endotoxine aus gramnegativen Bakterien. Der Assay wird in Glasröhrchen bei 37°C durchgeführt. Nach einer Stunde Inkubation in einem Wasserbad oder Inkubationsblock werden die Röhrchen um 180°C gewendet.  Die Ausbildung einer gelartigen Matrix gibt den Hinweis für das Vorhandensein einer Endotoxinkontamination.

Kinetic Turbidimetric LAL Assays

Für eine quantitative Endotoxin-Bestimmung bietet Lonza die sog. Kinetic Turbidimetric LAL Assays an. Diese Methode wird in einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Ein entsprechendes Gerät misst bei der Wellenlänge 340 nm und bei 37°C die Zunahme der optischen Dichte zu verschiedenen Zeitpunkten. Endotoxin-hältige Proben zeigen einen schnelleren Anstieg des OD-Werts als nicht-kontaminierte Proben. Anhand mitgeführter Standards können Endotoxin-Konzentrationen von Proben bestimmt werden.

Endpoint chromogenic LAL Assays

Diese Methode wird in Röhrchen oder in Mikrotiterplatten durchgeführt. Nach einer bestimmten Zeit verfärbt sich das Reaktionsgemisch gelb und kann mit einem Photometer bei 405-410 nm gemessen werden. Positive Proben ergeben eine stärkere Verfärbung, bzw. höheren OD-Wert. Mit Hilfe eines mitgeführten Standards lassen sich Probenwerte quantitativ auswerten.

Kinetic Chromogenic LAL Assays

Ähnlich wie der Endpoint Chromogenic LAL Assay wird bei dieser Methode ein Absorbanzwert bei 405-410 nm aufgenommen. Diese Tests eignen sich besonders für die Qualitätskontrolle von biologischen Produkten, z.B. Vakzine oder Antibiotika. Der Sensitivitätsbereich liegt zwischen 0,005 und 50 EU/mL.

PyroGene Endpoint Fluorogenic LAL Assays

Der PyroGene Assay ist eine verlässliche Alternative zu den herkömmlichen Endotoxin Tests.  Er beruht auf der Aktivierung des rekombinant hergestellten Faktor C, ein Endotoxin-sensitives Protein, welches die traditionelle LAL-Kaskade initiiert. Die Messung erfolgt mit einem Fluoreszenz-Reader (ex: 380 nm/ em: 440 nm) in einer Mikrotiterplatte. Standards erlauben eine Quantifizierung von positiven Proben im Bereich 0,01-10 EU/mL.

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